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125最准一波中特:徕卡显微镜:明亮的荧光共振扫描

2013-10-16  发布者:admin 

观察的快速生物过程需要高速成像系统。共聚焦扫描显微镜有一个固有的障碍:串行记录的图像元素。因此,基于摄像头的系统,或其它的方法(不是真正的共焦扫描方法)被应用。

对于真正的共聚焦扫描系统,只有更高的扫描速度可以提高时间分辨率。因此,谐振扫描系统已允许行频率最高为16千赫(非共振扫描仪相比,3千赫)。信号噪声的讨论带来了意想不到的好处共振扫描:,荧光亮和荧光染料照片预应力。

Fotolia

 

真正的激光共聚焦扫描照明模式

真正的共焦成像需要一次在单个点的照明和观察。为了创建一个二维图像,这点需要扫描的区域,该区域将被成像。扫描通常是由两个反射镜,可以指向在x方向和y方向的斑点。像在其他的扫描系统(例如光栅电子显微镜或 20 世纪的电视管),光点扫描线由左到右(x方向)和从顶部到底部的?。▂方向)。

样品中的某个位置(例如一个荧光的位置),经历了一个光脉冲,每次束移到那个位置。现货理想艾里形。照明的持续时间,即τ p通过的位置,依赖于波长和NA 的时候,样品中的实际的扫描速度和衍射图案交叉的位置时的高度。衍射图案通常远大于荧光染料(150 ... 1000海里与2 ... 20纳米)。

对任意图像进行扫描,会体验到一种荧光染料,如在图1中所示的照明脉冲模式。灯饰由于过采样之间的时间间隔的1 / f L,f L表示该线路频率。真正的共聚焦显微镜的典型线路频率躺在1千赫左右,但可能范围从10 Hz?2 kHz的。

记录,可对每个图像,的flourochrome会遇到如上述的照明脉冲图形。脉冲模式之间的时间是由图像重复时间的1 /女F,无论是有限的扫描速度(通常简称为帧每秒“?。┗蚬室庋映?,这是典型的延时实验生理学。F F 表示“帧频”。

(注释:对于仿真,可以假设,只穿过一次,每帧的矩形脉冲,后者的假设是与过采样(奈奎斯特 - 香农)的要求相矛盾,但并不主要干扰的影响,三重峰积累)。

Figure-1

 1:受衍射限制的点扫描的图像的过程的。被照亮的特征(比较小的衍射光斑延长)多次,这里表示的线K,L和m。每一次,衍射图案是不同的,根据模式和扫描线的距离的几何形状。

 

 

 

低剂量率:更少的三重态

脉冲扫描图像中的照明和荧光过程,涉及三重态(这是最常见的标准荧光染料)的概念,我们现在可以了解真正的共焦扫描系统具有快速(相比较低的高速扫描仪)的结果建议一个更好的荧光信号和漂白时,用人共振扫描系统。

如果没有三胞胎本,照度的量子产率的荧光团的荧光光子的量将取决于。的照明接通时,排放量将增加(增加的速度取决于荧光寿命),并保持在一个恒定的水平。只要我们允许有些激动分子搬离到三重态,他们不再是可产生荧光光子。因此,排放量将减少。我们甚至可以假设所有的分子都在三重态的情况下,只有非常偶然,三重态松弛到基态时,荧光机械工作很短的时刻,冒出一些光子,并尽快停止分子进行系统间的过渡和保持暗三重态。这种极端的情况是一个现代化的超分辨率技术:地面状态耗?。℅SD)的基础。但是,即使在极端条件下少,三重态减少的金额准备发射的荧光染料。和从T到G的松弛慢(取决于分子的量子参数)。

如果我们停止照明,荧光显示实际的荧光衰减时间将减少。渐渐的,速度却慢得多,三重态分子也将返回到基态,当他们准备再次产生荧光。显然,很重要,无论我们试图得到的排放,在一个单一的,长的照明(三重态强度降低),或在一对夫妇的小剂量用一些时间来放松之间(仍然假设总照射剂量是恒定的?。┰诤笳叩那榭鱿氯绻贸∷窃谌厮沙冢≧)或更长的时间的范围内,我们将收集更多的光子,在末端。这是明亮的成像在同等照度剂量相同。

避免三重态有一个额外的好处:的样本将漂白少。作为指出,很大一部分是由于漂白激发三重态。如果我们能够避免这些国家的积累,分子光化学解体的风险较小。

  1. 低线频率增加照明脉冲之间的恢复时间,但也增加的照明脉冲时间,更慢点动过样品。一般,这种较慢的运动增加了三重峰浓度。只有非常低的强度,可避免这种效果。
  2. 高线频率缩短照明脉冲之间的时间,从而增加了三重积累。另一方面,每脉冲的光照时间是较短的,因此较少的三胞胎被累积。
  3. 如果相同剂量的光施加在小剂量乘以频率的n倍,累积或平均n次,将增加,如果总的荧光衰减时间显着长于脉冲之间的渡假。在这里,共振扫描仪是最有益的。
  4. 如果三重峰衰减慢于行频,隔行扫描的过采样将提高信号。在这里,后续帧收集信息,否则重叠线。例如先扫描线每5 ,2 扫描,每5  + 1行...等等。在这种情况下,照明脉冲之间的三重恢复允许的时间帧频率f F统治。
  5. 在任何情况下,最好是使用短的照明脉冲,即快线频率。共振扫描系统(目前,振镜光学扫描设备提供高达20 kHz),因此提高了信号 - 噪音和减少漂白和光毒性一般选项。

Figure-3_07

 3:分裂荧光照射剂量。在左侧,单剂量应用。荧光强度显示为绿色。由于三重峰积累(红色曲线)时,荧光强度降低。总收率类似绿色曲线下方的面积。在右边,相同剂量应用分成两半。在休息时间,三重积累消失(红色曲线)和荧光再像以前一样强烈。这里的两个区域和大的产率相比,在单脉冲实验。

三重态,荧光暗态

适当的色彩与光(光子能量)照明时,荧光染料可以吸收从地面状态G,光子和过境到激发态E.在分子中,这些状态显示了一系列的子状态(振动状态)。当兴奋到这些振动状态,分子很快会放松到最低的子状态(在低温下,如室温)。从激发态,分子将返回到基态。典型的剩余时间在激发态取决于分子中的电子系统中,被称为“荧光”。激发态衰变到地面状态指数。在适当的条件下,衰减其他光子触发。这种现象被称为受激发射(见STED超高分辨率显微镜)。过渡到基态时,能量被释放通过发射一个光子。在共同的荧光过程(自发辐射),所发射的光子的能量是由振动能量差小于激发光子的能量。因此,有一个更短的波长(激发),以较长的波长(发射)的斯托克斯位移(Stokes shift)。

根据分子上,也有可能被耗尽后,激发态的其他途径。最突出的非荧光的方法之一是一个所谓的“系统之间的十字路口”,ISC。在这里,的分子进入状态,大力E和G.之间对于量子力学的原因,这种状态被称为“三重态的”T,从这里到地面状态的衰减很慢。因此,分子是“关闭”假设三重态的时间。还有其他一些国家,其中一个荧光非荧光,尤其是最重要的荧光蛋白显示各种“黑暗状态”,不一定三重态。这里发现荧光产量报告也将适用于非三重黑暗状态。不可逆的荧光破坏(漂白),可能需要不同的论证。

三重态的讨论用于漂白的主要来源之一。尤其是激发三重态倾向于与分子化学中断。在模拟中为了简单起见,可以假设所有荧光染料三重态吸收额外的光子将被不可逆地破坏(漂白)。

Figure-2

 2:雅布隆斯基图荧光激发,发射和三重转换。可能被激发荧光(防爆)从地面状态G到激发态E.该系统将很快放松在热亚(虚线,适用于所有过渡)最低。从兴奋状态,系统可以返回到基态(EM)所释放出的能量作为发射光子。兴奋状态,也可以输入一个三重态T系统间穿越过程(ISC)。从这里,它可能慢慢返回到基态(R)。或者,特别是在吸收进一步的能量,分子化学分解,因此结束漂白的(BL)。

 



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