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125期一波中特:徕卡显微镜:如何定义收集特定探头发射的波段

2013-10-16  发布者:admin 

由分束器或色散元件。来分隔多个排放量由它们的颜色,不同颜色的光,第一引导到不同的空间方向,到达传感器之前,引入带通滤波器,以减少串音或删除任何剩余激发光。经典的,则此任务已离开共同的玻璃基带通滤波器。革命性的设计使用光度计滑块的多波段组件- SP的探测器。这个概念允许极其高效的感应发射光,并同时提供了完整的可调谐。一个“副作用菜”选择要录制光谱扫描。有其他光谱的记录装置,根据由检测元件的阵列的固定频带,但它们是不可调整的,较不敏感的。

Fig-00-1

 

Fotolia

 1:经典的带通滤波器的基础上染色玻璃或干扰涂料。要更改的检测频带,必须对过滤器进行交换。这需要很多的过滤眼镜和一个机动的交换设备(©fotovika - Fotolia.com)。

 

 

多波段分光光度计:SP探测器

从整个频谱中选择所需波段的一个完全不同的方法是使用机械装置,折叠带频谱。如果光通过色散元件(棱镜或光栅)中,组件的空间取决于他们的能量传播。光子的能量对应的颜色。在简单的情况下,所得到的频谱是一个白色的表面投影到可视化。很长一段时间,相纸被用于文档和量化。如今,数字相机芯片实现光谱(分光器),用于查看和分析。

另外,也可以通过插入一个机械狭缝的白色表面的位置,并测量所传输的能量,选择一个从整个频谱的窄频带。的狭缝的位置可移到频谱的能量分布(光谱仪)的位置的函数,然后测量。

为了测量整个发光物种的能量,其特征是它的颜色,一个可以打开的狭缝中间处,使窗口覆盖发射和拒绝其他部分的光谱。这样的装置,它具有带通滤波器在中心频率和带宽的优点,可调谐性 - 它包括任何(单体),可以设计在给定的频谱的带滤波器的电势。用适当的传感器(PMT或路政署)相结合,这样的设备是最通用的探测器共聚焦显微镜(最敏感的为好)。

正如到目前为止所描述的,这样的频带光谱仪可以作为一个单通道实验。然而,现代的荧光在生物医学研究需要同时记录多个通道。巧妙地解决了这个任务的解决方案是通过级联机械狭缝装置。在这种多频带检测系统(进一步称为“SP检测器”),机械狭缝元素被表示为高反射镜。的狭缝,将发送第一信道所需的波长带,但频谱的其余部分被引导,几乎没有损失,随后,再次有反射镜滑块频带选择的检测器。从理论上讲,一个无限数目这种级联的频带探测器是可能的。对于现实的原因,目前器件具有多达5个传感器。

这个概念的美是高效率(狭缝传输100%,反映99%)和独立自由光谱可调谐的所有频段。此外,每个通道都配有它自己的传感器,允许独立的电子放大和基线设置。

Figure-4-2sp_rechts

2:SP探测器采用高传输性能和白色玻璃棱镜。被分离成频带的频谱通过可动反射镜滑块。这允许在任何可能的子集光谱,然后记录,可作为??检测信道的频谱被分割。

 

其他的方法

引入后的SP检测器,以及其他的设计被出版,试图匹配的多频带的方法的好处。其中之一采用阵列检测器,通常多阳极的光谱投射到其上的光电倍增管。虽然这些设备有可能增加记录的信号的数目,更简单地说,它们具有显着的缺点:多阳极数组的使用减少由于分部必要的机械分离收集的光子。他们遭受的光学和电子串扰,他们没有办法提供单独调整放大功率。本质上是固定的频带,即不可调的,因此没有适应各种今天所使用的荧光染料的发射特性的影响 - 在今后不断增加的复杂性的。设备不输出信号被分配到各个排放种类,但只是固定的频谱的分数。因此,它们强制元分解算法,以获得有意义的信道数据的装置所记录的数据的后处理。(配SP检测器,信号分配给发射物种,解混一个选项来清除剩余的重叠在这里)。

阵列检测器也强制要求的发射光谱线性色散。因此,采用棱镜阵列检测器的系统中是不可能的。出于这个原因,光栅被使用,它在性能上有重大的缺点。光栅没有平面(白)输出,但发挥最大闪耀波长。因此被低估更长和更短的波长收集的数据。光栅也强烈依赖于偏振的,非偏振光的(这是典型的生物荧光发射)的效率降低约50%-70%(于表现最好的颜色)。已作出尝试修复这个缺陷与额外的光学元件。光栅的第三个问题是输入能量的事实,不仅在一个单一的光谱,也可进入 0 阶和高阶的光分散,释放。这就降低了整体的效率,在所有光栅。在这里,已经引入了附加的光学装置,为了解决这个问题。

在这些设备都是基于记录光谱的想法。然而:不需要荧光成像光谱进行记录,非常罕见的情况下除外。低效获得的光谱需要重新计算提供有意义染料信息。SP探测器不会受到高阶损失,也不偏振依赖性。它提供了完全可调的检测带,个别放大。它允许线性分解的情况下,这是有益的, -作为一个额外的好处-它可以记录在高分辨率光谱。

Spectral-detection-Figure-3

 3:单独的点式探测器(SP检测器)允许调整样品中的各种染料的排放量中的动态差异。检测窗口可调的动态范围是单独的适应性(多阳极阵列解决方案相反)。

玻璃过滤器

在过去,一波中特打一肖,几乎总是配备玻璃屏障过滤器过滤器。非常早期的荧光显微镜透射系统建成,也就是说,它们在透射光下操作。这种技术完全取代落射光束路径(入射光)。入射光的系统有一个更好的激发和发射的分离,这是一项重要的要求,作为荧光的光只有约10 -4 10 -10倍的照明。屏障过滤器必须满足两个任务:第一,尽可能阻止尽可能多的寄生光(剩余激发光路径达到检测样品中由于反射或光学元件)。其次,阻挡过滤器是用来进一步缩小所收集的色频带的信道信号,以提高特异性,如果样品中含有多个荧光物种(减少串扰)。

玻璃过滤器可以由染色玻璃材料,这是可以在许多不同的颜色。然而,染色玻璃的性能取决于所使用的化合物,没有选项设计以外的各种化学品的混合,接近所需的传输特性的光谱特性。设计更加灵活,是基于干涉效应的多层膜沉积在透明玻璃的过滤器。这种涂层提供的选项设计更多或更少的任何可见光谱内的带通。更复杂的涂料可以作为多频带过滤器,具有三个或四个波段的传输与反射部分之间,允许多个激发和检测。

虽然先进的多层镀膜技术上先进,此类设备的限制是他们的intunability。以服务为众多的染料和染料组合,一个系统必须配备这种过滤器具有将被插入到光束路径根据需要,通过手动或电动操作的集合。这使得基于过滤器的系统非常灵活,慢慢适应。

 



沪公网安备 31011202003519号

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