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波叔一波中特彩图 图:尼康显微镜,目镜测微尺的介绍

2013-12-11  发布者:admin 

长度的所有测量都是基于对象的正在审议与另一种已知的尺寸,或具有标准化,标定比例的比较。为了确定一个木板的长度或宽度,例如,一把尺子或卷尺放在与板接触和尺寸都注意到直接比较标尺上的刻度数值标记。

这个基本原理是适用于在显微镜下观察试样的测量,但在实践中,它往往是无法实现的化合物显微镜放置尺子与试样直接接触(尽管这通常是在低倍率立体显微镜进行) 。 在复合光学显微镜进行测量,在高放大倍率的替代机制必须采用的,最常见的是在组合目镜分划板与微米级的应用。 大多数与复合显微镜进行测量落入0.2微米到25毫米。(广角目镜的平均场直径)的尺寸范围。 低于0.2微米的水平距离是在显微镜的分辨能力的下方,并且长度比的视广角目镜的场较大,通常(且更为方便)用立体显微镜测定。

如图1中所示的是现代显微镜目镜(通常被称为一种 )配备有一个内部标线片的规模。 还介绍了图中的是一个舞台微米,其中包含被细分为10和100微米的增量小金属化毫米的尺子。并列在目镜分划板的刻度与舞台上的千分尺使显微镜校准标线仪和样品进行线性测量。

用光学显微镜进行了第一次报告的测量由荷兰科学家安东尼凡列文虎克,谁用砂的细颗粒作为计,以确定人类红细胞的大小进行了在17世纪末期。 自那时起,无数的方法已被用于测量线性,面积和体积试样尺寸与显微镜(称为测微形态测量实践),以及各种有用的技术已经出现在过去的几百年。 许多这些方法都具有实际用途,并可以被分隔成若干广义的类别,概述如下

  • 由试样尺寸的直接比较在x获得的微米级的测量-显微镜y平面上(例如,使用机械校准阶段,并专门测量显微镜)。 机械级使能在x轴和y轴的运动,并且常常采用一个副尺刻度,使读数台的位移与0.1毫米(该方法的准确度)的精度。

  • ,利用投影的实像和那些由传统或数字相机系统结合了微尺的方法制作的技术。 由于微米尺度的同时与试样没有观察时,千分尺的图像,必须通过显微照片或数字相机系统的装置被记录。 这种技术是精确到微米或更小重复性非常高,往往收效。

  • 通过投射的测量刻度进入视场或通过包括与试样具有已知大小的物体而得到的线性比较。 通常,聚苯乙烯或玻璃珠均匀的制剂可以包含与标本,如红细胞,以提供大小参考。 测量,然后进行利用显微照片或数字图像。 该方法的准确度是可变的,并且取决于所述比较的对象的同质性。

  • 直接测量试样通过位于显微镜内刻度尺,如含有固定或可移动的掩模版(最常用的方法)的目镜来进行。 光罩必须连同一个阶段微米校准,但提供的约2-10微米(3?5%,这取决于倍率和镜台测微计的分辨率)的精度。

  • 校准的显微镜载玻片和计数室被用于直接线性测量或计数样品粒子的密度。 精度取决于10和50微米之间分格线,但平均值之间的间隔距离。

  • 显微镜的固定尺寸可以被用来产生试样尺寸的粗略估计。 通过测量或计算的视场的大小,一个装标本的相对线性尺寸可以被确定。

  • 确定沿显微镜光轴(z轴方向 )通过利用在显微镜校准的精聚焦调整垂直距离。 这种技术通常被折射的工件和球面像差变得复杂,但可以提供几微米的平均精确度水平。

一些被通常用于对象(样本),两者在显微镜和在日?;肪车牟饬康募际?,涉及的转印比例的原理。 直接比较测量需要在审议访问对象,并准确的标尺或刻度。 如果测量是必要的,没有合适的尺子可用于比较,转印规模往往可以用来确定关键尺寸。 传输尺度可以是任何合适的替代品,可以放置在与对象接触,从而使对象的长度(或宽度),以直接比较,或转印到转印规模。 对象的绝对尺寸后的比较来校准刻度(或直尺)测定。 如果传输规模本身被标记以任意单位的刻度,则刻度必须通过比较标准的引用到绝对单位。

共聚焦成像焦平面

转移规模的原则已被用于从人类最早的天日?;疃?,并可以应用到研究中,尽管他们可能不直接测量与标准化规模进入显微镜标本。 有各种方法,采用转移规模显微镜,包括将规模上使用的透明材料具有拉伸管,或者直接在投影图像进行测量。 另一种方法是,拍摄或雕刻的规模到玻璃元件,它可以在显微镜的成像共轭平面中的一个被放置在光路中,以便它可以在锐聚焦叠加的试样图像上被观察到。 前的定量测量可以被执行,转移规模的任意分割必须通过比较到主刻度的绝对刻度,诸如微尺进行校准。

各种各样的试样可直接安装到显微镜校准刻度,如印在专门测量幻灯片,并测量然后可以通过使用绝对单位来进行。 如果这是不可能的,那么转印尺度的图像必须被叠加到,在上面描述的方式的标本。 最常用的技术目前用于测量样品特性与光学显微镜是特征尺寸带有刻度的地理位置优越,在光学显微镜下火车的刻度比较。 为了进行直接比较测量,在显微镜内的规模必须同时出现在大家关注的焦点与样品。

在叠加刻度尺到样品,以这样一种方式,它可以与样品进行成像的关键要求,是将刻度的显微镜的合适的共轭面。 的原则,共轭焦平面两个主套沿着正确聚焦和对准复式显微镜的光轴发生。 一平面集合包括四个图像形成或场平面 (参见图2),而其他包括四个照明孔径平面。 集内的每个平面被称为共轭与该组中的其他飞机,因为它们是同时在焦点,并且可以被看作通过显微镜观察样品时,叠加在彼此之上。 放置在一个共轭组的一个平面上的对象将在同一组的所有其它共轭平面中出现尖锐焦点。 很明显,如果一个刻度是同时观察试样的图像是可见的,并在焦点中,规模必须放置在成象平面集合中的一个。

示于图2是一个典型的透射光显微镜和光学系(在该图的左手侧)的示意图的共同图像形成共轭平面。 在光学路径电位测量分划板位置是目镜固定光阑,试样平面上,并且视场光阑。 掩模版还可以(理论上)被定位在相机和/或视网膜图像平面,但该过程是很难完成的,不切实际的,并且通常没有必要。 注意,视场光阑的显微镜垂直照明,用于落射照明,也是合适的(但难以进入)位置设计成在反射光显微镜进行测量分划板。

从考虑缀合物的成象平面的清单,但很明显,一种可能的位置为一个刻度是被照明视场光阑的平面。 一个规模放置在视场光阑的平面将同时出现在重点用显微镜舞台上的标本(见图2)。尽管许多技术用于在该位置上插入一个测量刻度已经报道,这是不容易实现的许多显微镜的设计,主要是由于在获得的可变光阑的难度。 大多数现代显微镜都与视场光阑位于仪器和不可访问的运营商的基地内构成。 除非刻度可以精确的视场光阑的平面定位,冷凝器必须沿着光轴(散焦),以使该比例为焦点重新定位。 因此,在改变显微镜配置有可能,要实现真正的科勒照明所需的显著差异。

目镜设计

中间像平面在图像形成共轭设置测??量刻度可以被插入在其中的备用位置。 这架飞机正好与目镜固定的隔膜,这是一般交通方便(图2)。 几乎任何目镜可以安装一个刻度在焦平面,将目镜插入在显微镜下观察样品的特性的测量装置。 目镜秤通常被称为十字准线 ,尽管术语手提袋 ,或刻度被普遍使用在同样的意义,并经常在文献中遇到的问题。 最常见的常规目镜的不同之处相对于固定膜片的物理位置。 一些目镜设计位置隔膜在单元(透镜之间)的中心,而其它的模型有一个固定的隔膜在目镜的基础上,下方,和外部,该透镜组件。 在这两个目镜样式,视场光阑位于所述中间图像的焦平面,但外部隔膜设计是优选的测量,因为任何掩模版,指针或其它规模将目镜的光学系统之外。

一个最简单的目镜设计,被称为惠更斯 (或惠更斯 )目镜,由搭载有它们的面向目标的凸表面(如图3)2平凸透镜。 最靠近眼睛的透镜被称为眼透镜 ,和一个更接近目标被称为场透镜。 这种类型的目镜是未校正的光学像差,并具有图像平面位于所述两个透镜(内部隔膜)之间的缺点。 因此,掩模版的精度是由单独的眼透镜的像差的影响,同时样品图像从场镜,以及所产生的任何光学缺陷受到影响。

冉斯登目镜具有结构基序相似的惠更斯目镜,除了场透镜的方向为平面表面面向目标(图3)。 此外,焦平面和隔膜位于所述光学系统(外部振膜设计)以外,只是场透镜的下方。 放置在膜片A线网或类似规模将经历比用惠更斯设计失真更小,并且在目镜的任何光学象差将同样会影响样品和分划板的图像。 一个冉斯登目镜的主要应用之一是在测微。

拉姆斯登的设计,被称为凯尔纳目镜的更高度纠正和完善的版本,采用了消色差双的眼睛晶状体更充分正确的色场透镜的像差。 凯尔纳目镜(图3中未示出)还配备了高眼点,这是非常有用的操作符戴眼镜,但他们引入一个小程度的扭曲的形象。 因为较低的焦平面是外部在凯尔纳目镜光学系统中,像差影响的中间图像和目镜标线片相等的,因此,这种目镜式是理想的导通与显微镜精确测量。 许多无限远校正显微镜配置由制造商提供凯尔纳式目镜,这是一种具有可移动的固定光阑管拧入目镜桶的下部。 除去膜片管和安装在光罩的能够容易地实现在几分钟无目镜内部透镜元件支架的拆卸。

在引入无限远校正光学系统,补偿目镜被用于帮助色差校正。 这些目镜一般设计有两个独立的透镜,一个或两者均为双峰或三峰(参见图3;广角目镜)。 补偿目镜可以通过彩色边缘周围出现的固定隔膜的内侧边缘被识别时,目镜在明亮的光源前被视为(普通目镜显示一个蓝色的条纹,而补偿目镜呈现出黄色,橙色或蓝色条纹)。 倍率色差异,共同所有的高功率目标的像差,可以由光学系统耦合到一个补偿目镜校正。 此外,补偿目镜被设计来校正图像的曲率,以在有限的程度。

对分划板放置的正确位置是视场光阑或目镜,它位于中间像方焦平面的固定隔膜。 现代目镜通常包含可从目镜,用于插入一个分划板的底部将其拧下固定环。 后光罩正确就位的固定光阑,保持环被重新插入并拧紧。 体视显微镜目镜通常包含用于安装光罩弹簧式持有人。 固井光罩到保持器将确保适当的取向,并且整个组件被插入到目镜镜筒和移向眼透镜,直到取得正确聚焦。 分划板保持器将保持恒定的位置,由于保持器上的目镜镜筒的侧面的弹簧张力。 分划板的焦点可以被改变以适应观察者的眼睛通过翻译整个组件上升或下降。 使用这种类型的分划板保持器的前,目镜的隔膜必须被移除以允许掩模版夹持器滑入目镜管。

载物台测微尺

如前所述,线性测量需要的对象也可以具有标准化尺度,如尺子测量的比较。 在利用目镜标线片或目镜测微计在显微镜下测量,转印刻度(标线片),这是该试样的图像叠加后的任意单位,必须转换成绝对单位,如毫米或微米。 通常是通过成像的镜台测微计具有相同的目的也可以用于样品的测量进行的分划板刻度分度的刻度。 一个适当的校准包括确定在舞台微米的绝对距离,成像到位的标本,它对应于规模的一个师在目镜分划板的。 这个值通常被称之为千分尺的值 ,或者校正因子 ,用于特定的目的。 一旦该值已经确定,任何样品特征的尺寸可以通过乘以与正在使用的物镜的校正因子的特征跨区目镜标线片的分割数来计算。

阶段微米设计用于采用透射光显微镜的应用包括具有刻度限定长度的直接附着到表面上,或优选地,夹在已知厚度的玻璃盖的下方一个标准大小的显微镜载片上(1×3英寸)的。 微米通常具有长的刻度尺一个或两个毫米,细分为单位,每单位长度的十分之一毫米(100微米为单位)。 每100微米的单元被进一步分成10等分,从而产生相当于10微米的最小刻度。

大多数显微镜物镜与标准厚度(0.17毫米),一个盖玻片利用被校正的,因此,这是最常用的盖玻片的厚度为微米级尺度。 微米也可提供无盖玻片,而这类型应与被校正零厚度的盖玻片(或缺乏盖玻片)反射光的目标使用。 某些阶段微米设计利用金属板,大小相等,以一个标准显微镜载玻片,作为被印或刻有刻度的小圆形玻璃嵌入载体。

的实际测量尺度可能由照相工艺来制造,但此法所得的线不锋利而准确地定义为那些通过物理雕镂线形成。 用于产生尖锐微米线的另一种方法是在金属膜的电沉积直接在显微镜载玻片上的玻璃表面。 在许多舞台微米,鳞片是由一条黑线,简化定位分钟刻度的任务,并协助粗糙聚焦显微镜包围。 虽然照相制作微米足以应付日常工作,特别是在较低的放大倍率,其线条太粗糙沿边缘和太宽的精确测量,或使用在高放大倍率。 这些微米应仅限于粗略测量在低倍率。

在利用反射照明光(反射光)的应用,在透明玻璃微尺的设计是不适合的,而直接在高度抛光的金属刻鳞被代替使用。 用落射照明,如在反射光利用金相显微镜物镜,用于通常校正未经盖玻片,并需要一个阶段微米未经盖玻片在判决进行准确的测量。 因此,未受?;さ某叨群苋菀资艿缴撕?,必须非常小心处理,以避免刮伤和污染灰尘,污垢,指纹或其他杂物。

目镜十字线校准

目镜分划板(确定的千分尺刻度的关系)对特定目标的校准通常是按照以下所描述的推荐程序(参见图4)进行。 注意,只对特定的目标/目镜组合被测试,并且在显微镜的特定机械管长度的目镜标线片的那个校准成立。 为了避免不必要的重复的过程,每个组合的校准信息应记录并存储在附近的显微镜工作站的便利位置。

  • 后确保显微镜对准并配置为科勒照明,插入适当的掩模版到显微镜目镜和使玻璃分划板盘的表面上的刻刻度显示清晰地聚焦调整眼透镜。 仔细检查分划板的方向,以确认位置上方或下方的刻线数量也不予转回。 这个任务可以通过按住目镜在明亮的光源前,通过眼睛盯着镜头来完成。 最后,调整显微镜双目瞳孔间距和以后测量记录此值。 如果该显微镜配备有补偿在两个目镜调整(如大多数现代显微镜的情况下),掩模版的校准值将是正确的任何瞳孔间距。

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  • 放置镜台测微显微镜舞台上,并把微米尺度成焦点采用显微镜粗微调焦控制旋钮。检测规模,将其转换为视场的中心是通过采用低功耗的目标促进先找到周围的刻度圈,然后规模本身。 环包围微米尺度是用肉眼可见的,因此应该使用来定位微尺在显微镜光路中(第一阶段孔径)的中心。 此外,几个阶段微米设计有刻从戒指到规模,这也有利于在使用高倍率的目标定位时规模的边缘线。 旋转的预期目标到位,并确保两个秤(台千分尺和目镜分划板)是在同时进行重点视场可见。

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  • 翻译阶段,使用x - γ运动控制旋钮或手柄,和/或旋转目镜(及其分划板),以使两个尺度成平行取向(图4(a)和图4(b))。 现代机械阶段通常具有围绕显微镜光轴的有限度的转动运动。 在这种情况下,松开翼形螺钉(通常位于舞台的前部,将试样台的下方)并旋转阶段,直到微米和目镜标线片是平行的。

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  • 直接定位在目镜标线片在微米(与阶段控制)和对齐的分划板上的左手定则与1的长,编号台上微米(100微米)的分割线(图4(b))。 根据不同的目的倍率和目镜场直径,距离150微米和4毫米(阶段微米尺度的长度的两倍)之间的范围内将是可见的目镜。 在100至1000微米(10至100规则)在舞台微米的距离,确定两个点在哪个分划板和微米尺度完全匹配(参见图4)。 为了获得最准确的测量,利用两个尺度上的最大可能范围划分的。 只有偶尔做掩模版和镜台测微计的刻度重合在其整个长度在目镜可见,但是这往往与制造用于特定目镜标线片的情况。 最后,确定目镜规模参照舞台微米的分歧明显的长度。

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  • 为正在使用的物镜的千分尺的值可以通过将阶段微米的选择区域的已知长度的目镜刻度的分割数对应的计算。 其结果将产生每刻度上的分划板刻度为目标的距离,一个量通常被称为校准常数 。 叠加在一台测微尺在图4中,标线片(b)示出标记20的左手法则(标记为0)上的分划板与镜台测微计师的对准。 这两个规则的重叠是由红线清晰显示。 发生重叠的下一个区域,在舞台上的千分尺标有30的规则与目镜分划板的7.5马克一致。 因此,该阶段微米的100微米的区域等于7.5分划板的分裂。 目镜标线片的各划分,因此,对应于13.3微米,对于特定的目标/目镜组合被校准。 适当的分划板校准计算显著数字的数量应进行仔细的审查。 因为在光学显微镜的最小可分辨距离约为0.2微米(在最佳情况下),低于该值的线性测量,不能精确地确定。

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  • 进行精确测量时使用配备有变焦光学系统的显微镜,有必要使用一个阶段微米,以显微镜各变焦设定。 虽然许多显微镜变焦环和控制旋钮都毕业于名义物镜放大倍数,这几乎是不可能的变焦控制返回完全相同的位置,一个必要条件精确测量。

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  • 后在目镜标线片已校准的阶段千分尺,试样的线性尺寸均可测量。 所有测量,最高放大倍数的物镜应选择使感兴趣的整个标本的功能下降光罩规模的跨度之内。 东方的光罩尺寸与试样地区备受瞩目的轮廓相吻合。 接着,将试样转移至左边缘带编号的行中的目镜标线片重合,并且计数由目标区域跨越尺度分割数。 仔细估算师的任何部分。 为了提高精度,开展对大型样品多次测量。 当圆形或椭圆形的样品被测量(如血细胞,酵母,细菌等),记录至少20名来自不同域的尺寸。 正在研究在图4(c)的试样是人类的头皮头发轴,它是在直径约93微米(测量与校准的标线片,如上面所讨论的)。

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刚才所描述的校准过程必须,当然,可以重复每个目标要被用于线性测量。 应当指出的是放大倍数由几百分之刻有相同的放大倍数(例如,10倍)相似目标(即使来自同一制造商)而变化,所以每一个目标应该被独立地计算。 如果显微镜是经常与许多不同的目标时,它可能会更方便绘制校准曲线以图形形式的每一个目标。 这提供了一种简单的机制来快速确定而与显微镜的工作,而无需对所有的用于进行测量的目标施加微米的值时,重复运算的特征尺寸。

上述的校准程序提供的一个因素,其有效期为一个特定的光学组合,而不需要实际的物镜放大倍率,通常不同于压印在物镜镜筒的额定功率的知识。 在利用包含修正衣领,以适应变化的盖玻片厚度的目的,是要记住重要的是与衣领的不同设置的放大率的变化。 因此,确定这样一个目标的校准系数只适用于用于校准校正衣领设置。 目标具有可调整的套环,适用范围广的盖玻片的厚度提供校正,但也表现出倍率变化到高达15%,在整个调整范围。

目镜光罩及专业载物台测微尺

各种各样的目镜标线片的已经开发了许多线性,面积和计数测量与显微镜(见图5和6)。 简单的交叉线十字线(图5(a))通常作为一个定位标志,用于测量大型试样用有刻度的机械平台。 这种类型的掩模版也常用于配备为正交偏光照明,以帮助观察者在确定双折射样品的相对于偏振器的振动轴的方向的显微镜发现。 对于线性测量,无论是水平或垂直线规则叠加在所研究的样品特征的一个边缘。 接着,该带刻度的机械阶段被翻译无论是在x或y方向移动,直到相反的边缘与基准线一致时,与所述特征的大小通过检查尺度上的机械阶段确定的。 即采用机械测量阶段应重复从左到右(或从上到下),反之亦然舞台齿轮组,以补偿间隙误差。

水平和垂直分划板秤(图5(b)至图5(G))在宽的频谱配置的制造,以适应任何线性测量的要求。 毕业水平尺度(图5(b)-5(e)条)是最常见的,通常由细分为8,10或100师一个10毫米的规模。 这些光罩是所有样本的特征尺寸的测量是有用的,而且往往含有参考标记来帮助校准和测量。 越过微米尺度的光罩(图5(f)和5(g)条)被用于二维线性测量,或在独立的测量都是在垂直和水平方向上的便利。 锥形量规标线(图5(h)条)包括具有在每对线之间不同的间隙几个分格线对。 线对旁边刻是用镜台测微计分划板的校准的参考编号。锥形量规光罩是方便用于测量混合的纤维和类似的标本已经重复特征尺寸的尺寸。

旨在协助颗粒和纤维的分析光罩往往含有方格,地球仪,同心圆,和量角器,如图6所示。 广场和电网光罩(图6(a)至图6(d))受雇于小特征尺寸的系统测量或计数的微生物,血细胞和小颗粒。 在大多数情况下,试样的选定区域进行计数,并将结果乘以在感兴趣的整个区域上以得到定量结果。 其中最常见的计数应用需要米勒掩模版(图6(b)),其使操作者能够确定颗粒的数目在的小正方形1,然后将结果乘以计算出包含在所述颗粒的总数量分划板的界限。 米勒光罩也是有用的,以大的比例比较小的颗粒中的样品。 惠普尔光罩(图6(c))相类似的设计的米勒光罩,但目的是使更小的试样的特性的测量(颜料分散体,胶体颗粒,灰尘和细菌)。 专为随机分析与体视学(从二维样本推导三维数据的科学)光罩可在几个流行的设计(图6(d)就是一个例子)。

圆和角标线(通过6(小时)如图6(e)条),可在设计范围广泛,以容纳大量的测量要求。同心圆形光罩(图6(e)条)被用来进行二维测量类似于那些越过规模线性光罩进行。 然而,在这种情况下,(通常为圆形)的试样的中心被放置到与分划板的中心重合。 类似光罩以各种各样的组合(图6(f)到图6(H)),用于估计弧,角度和半径刻有量角器,轨距尺寸,和参考点。 有些光罩(图6(f)条)同时包含对标本的功能同时测量线性和角度的规则。这些测量光罩的典型标本磨料,化肥,纤维,细小的灰尘,颜料,植物种子,煤炭硅石,砂粒,土粒,和类似的粒子。

在半导体工业中,对掩模及硅片微观特征的尺寸和位置是要制造组装线的关键。 线宽的标准是用于维持在不同的植物在远程位置进行测量之间的一致性的校准标准(阶段微米)。 确定尺寸的钠钙玻璃板上涂有具有110和130纳米,2.6和3.4之间的光密度之间的厚度的防反射铬。 在标准的中心是一个明确的矩形测量4×5毫米,随着不良贷款的字母(缩写为国家物理实验室在特丁顿,英格兰),使易于识别的板中心。 线宽设置在8图案分组组成的具有标称宽度范围从0.25至10微米的不透明和清晰的线条。

另一类阶段微米,这是受欢迎的和经常使用的目标校准进行定量显微镜,是设计用于测量显微镜的光学系统的性能分辨率目标。 分辨率目标由含有正极,负极和/或半透明的图案分组,通常排列为多个行,并具有不同的宽度和长度的数字或在测试分自定义布局。 一个高性能的显微镜物镜的分辨能力往往可以准确地估计缜密侦查从合适的分辨率目标取得的成果。

包括在舞台微米的大类是校准的秤(前面已经详细讨论),取景标线,并计数室(见图7)。取景掩模版被用于定位的上一个样本的感兴趣区域,同时计数室被设计成使颗粒和细胞计数中的液体的特定体积。 计数室被广泛使用,用于计数的血细胞和精子,并且包括具有中心抛光厚的载玻片(图7)的和排除的平台。 该平台被定位在短距离(一般为0.1毫米)的下方双抛光盖玻片支持,以创建可以被填充有流体的精确数量的腔室。 在实践中,一个干净的玻璃盖玻片放置在所述腔室和中心定位在抛光支撑。 该裁定计数平台和盖玻片之间的差距等于100微米,和被统治(刻)面分为确切尺寸的平方。 其结果是,该液体放置在所述腔室的容积可以很容易地计算,得到每单位体积的粒子(细胞)中的悬浮液的数量的精确分析。

最常见的类型计数室中,其目的是用于计数血细胞,被称为血细胞计数器 (参见图7)。 几种不同的血球网格图案是由制造商提供,但大多数包含一个大的正方形边界细分成更小的正方形,以协助计数。 Hemacytometers通常用于计数和测量的颗粒大于约50至100微米以下。 通常,要被计数的样品必须精确地稀释系列稀释移液管填充计数室,以避免过多的微粒,可以是难以计数之前。 每个小方5?10颗粒的颗粒密度被认为是最佳的浓度进行定量分析。

丝状目镜测微

标准目镜标线片,当用精密微尺结合,提供了一种快速,方便,准确进行测量的显微镜装置。然而,对于更容易和更精确的测量(具有更大的客观性),一个专门的游标测微目镜,被称为丝状目镜测微尺 ,通常被认为是必不可少的。 这个特殊的测微目镜采用同样的原则作为一个标准的目镜和分划板的组合,但除了固定或移动刻度尺定位在焦平面上设有可移动的行规则(或行规则组)。 该丝袜微米避免了需要估计一个部门的分数上一个阶段微米(一个困难和主观机动),从而导致较大误差。

在一个丝袜微米的移动线的规则组的目的是跨视场来翻译,遍历一个固定副尺刻度,通过一个由旋转的外筒操作的精密丝杠机构的手段。 在一般的应用中,一个单一的规则或其它参考点(取决于特定的设计)对准样品特征的一端到被测量和校准滚筒的读数悉。 滚筒被旋转移动至整个样品特征的参考线,和一个第二读取在鼓的规模。 两个读数之间的差值得出样品特征测量一个明显的线性尺寸,并且当与镜台测微计进行校准,使一个绝对确定的特征尺寸。

一些丝袜微米设计变化由外筒,其允许所述滚筒规模为调零后的基准线被定位在对象的要测量的第一边缘包括掩模版尺度的额外运动。 此功能使每个测量开始与感光鼓上的刻度为零,并且避免了确定两个滚筒读数的差的必要性。 对于大多数丝袜微米,主要光罩尺寸为10毫米的行驶距离。 规模也分为100刻度与各部门代表0.1毫米。 测微螺旋鼓也被分成100的间隔,从而使感光鼓师之一间隔对应于0.1间隔目镜规模。 鼓满旋转平移整个目镜规模的一个间隔的测量规则(行)。

一些现代化的丝袜目镜测微尺样式包含一个内部变焦镜头系统,简化了千分尺校准与不同的目标。 目镜的下部包含一个刻度圈可旋转到光学改变有效管长,以叠加的微尺的刻度直接到丝袜微米的内部尺度。

轴向线性测量

标本深度的测量,同时在显微镜的光(或z)的轴,可以用显微镜具有刻度精细聚焦旋钮来进行。 在此之前进行轴向测量,各部门对毕业调焦旋钮的值必须确定。 在许多情况下,制造商可以提供这样的信息,但是它也可以用玻璃盖玻片实验测得的。 仔细测量盖玻片厚度与机械师的千分尺或卡尺(尽可能准确),然后放置在盖玻片的每一侧的标记用毡尖笔,奠定它到一个标准的显微镜载玻片的表面。 专注于标志放置在盖玻片上表面,并注意微调对焦旋钮刻度相对于参考点的位置。 找到并专注于下表面标记,并再次记录精细调焦旋钮的位置。 对应于精细调焦旋钮的各部门的轴向距离等于玻璃盖通过遍历从顶部至盖玻片的底部旋钮刻度的总数除以厚度(微米)。

为了测量样品的轴向尺寸,感兴趣的特征是位于视场和在显微镜聚焦在试样的底表面。 合焦后,对焦旋钮的确切位置被记录下来。 接着,焦点被移动到上部的样品表面和新的调焦旋钮的值,然后从从成像的底表面获得的1减去。 试样尺寸可以通过上面所讨论的,或由制造商提供的校准因子相乘的调焦旋钮的增量的数量来计算。

轴向测量是通过现场的波动,这部分是由物镜的数值孔径和放大倍数确定的样本深度复杂。几个额外的因素,其中必须解决的问题,是折射工件和球面像差时显著厚度的试样,通过水溶液或具有不均匀的折射率等(安装)介质进行成像,往往会发生。 还应当指出的是轴向测量相结合耦合到所述主观判断的最佳样本集中一个微米尺度的定量分析。 出于这个原因,许多显微镜不要依赖这种技术进行精确测量。

结论

即使是采取在操作显微镜,并在用于进行测量光罩的校准一个显著量的护理,有错误的几种可能的来源,可以影响校准过程中,以及对样品的特性的实际测量值。 使用镜台测微计校准目镜分划板时的一个重要考虑因素是包括许多舞台微米刻度尽可能在计算的。 这将最大限度地减少由于变化的各个刻度间隔,除了潜在的错误中准确地确定各行的边缘误差。 校准高倍物镜时,因为较少的刻度可以同时成像在显微镜视场平均在多个间隔成问题。 这是从来没有建议单靠一个10微米划分的准确性,因为各个刻度的宽度可以预期,从一个跨度略有不同到另一个。

刻度上的阶段微米的质量有对与该校准可进行高精度的显著作用,这一点尤其是在高放大倍率。 如前面所述,通过诸如薄膜沉积过程中产生微米通常具有更好的定义的边缘更精细的线条比那些照相产生的,并且能够提供更高的准确度和精确度。 照相制作微米尺度是比较经济,但线条,再加上线条之间随机分布的孤立银颗粒发生的毛边,使这种微米不适用于精确的测量。

可发生测量误差,如果采用有字段或图像失真的显著曲率的目标进行测量。 拥有现代化的目标,这种错误的来源并不像它在过去是常见,但是,它仍然是最好尽可能使用平场或计划目标。 如果必须使用具有某些字段失真客观,限制测量的视场的中心部分将减少测量误差。

在测量问题也可以由于难以精确地对准目镜标线片线与用于校正的阶段微米的发生。 一个高精度,毕业机械阶段(参见图9)可以被用来使该过程更容易完成。 现代毕业于阶段裁定以毫米为单位的两个轴并包含verniers翻译读数至0.1毫米。 这些阶段都相当适合在xy方向的大(超过几个毫米)测量。

这两个尺度(分划板和镜台测微计)被成像为急剧尽可能它是至关重要的,并且如前面所说,它是优选的,因为可以在视图中为校准场可以观察到利用阶段微米的许多部门。 目镜标线片与测微计的线的对准要始终从阶段微米线的规则相同的边缘进行,而不是在中心处(不能被再现地识别)。

这应该被视为测量误差的潜在来源的一个重要因素是参与设定的基准线在一个试样特征的边缘的主观性。 它应该在牢记的是,在显微镜下进行的测量,利用试样和未检体本身的光学图像。 在成像中使用的对比机制,光源的类型,质量,和数值孔径与物镜的其它性质都影响样品的外观特征边从该测量通常采取。 此外,如果衍射文物存在的形象,特征的选择对测量基准线的边缘位置可以是高度不确定的。

使用数字成像或传统显微摄影技术,线性试样尺寸可以通过直接测量的具体特点和比较的镜台测微计在同一放大倍数的图像来确定。 例如,拍摄了10倍的目标的试样可以通过在相同的放大倍数连续地获取阶段微米的第二照片来测量。 用一把尺子或类似测量装置,该显微镜可以再直接测量试样的功能和使用阶段微米的照片计算出尺寸。 该技术对于数字图像,其中计算机软件可以被用来代替一个标尺与一台测微尺比较样本图像时,两个图像被捕获在相同的像素分辨率同样有用。

在不透明物体的测量,图像的亮度在从明亮的背景上以深色样品的过渡主观评估可能会导致错误识别下与各种照明条件下所发生的不同强度梯度的尖锐边缘。 这是很难解释所有的实际显微镜错误的可能来源,但潜在的缺陷的认识可以帮助防止大的错误或不一致,比较已经由使用不同的仪器的技术和设备进行测量时尤其如此。



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